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万字干货关于PCR基因扩增仪的一切

发布时间:2022-07-29 04:11:43 来源:乐鱼app下载 作者:乐鱼app下载入口

  PCR是分子生物学研究极其重要的工具,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制,即人为创造核酸半保留复制条件,使目的DNA在细胞外完成扩增的过程,它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。

  PCR也叫基因扩增仪,主要用于用于科研及临床的基因扩增、定性PCR基因扩增、荧光/酶免终点定量DNA基因扩增、基因芯片等其他基因分析应用的基因扩增等。基因扩增仪适合国内外各种PCR试剂盒传染病类、肿瘤类、科研类。进口基因扩增仪主要由外壳、变温反应腔、散热系统、加热系统、制冷系统、电子控制系统、供电系统、人机界面等各部分组成。基因扩增仪广泛应用于各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

  今天小谱就其发展史、检测原理、结构和大家进行探讨,让基因扩增仪变的更简单。

  (如果读完文章您觉得还有哪些想听的知识点小谱没有讲到,亦或是觉得小谱文章中有哪些观点您不太认同,欢迎您积极留言。)

  核酸体外扩增的设想最早是由Khorana在1971年提出的。“经DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”

  然而当时还没有成熟的基因序列分析方法,也没有热稳定DNA聚合酶以及引物合成操作很困难。这种设想达不到实际的效果。并且在70年代初出现了分子克隆技术,一种克隆和扩增基因的途径被提供了,因此人们遗忘了Khorana的设想。

  1983年4月的一个星期五晚上,Kary Mullis开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法;

  1985年,Mullis在Cetus公司工作期间,发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多的模板DNA而烦恼;

  1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR的方法。

  根据PCR原理,商业公司在PCR仪的基础功能上不断进行创新和改进。至今,PCR仪已经更新至第三代技术。为方便读者朋友理解,本文将对三代PCR仪的原理、特点、主要厂商及产品、应用领域做一系统梳理。

  标准PCR仪也叫做终点PCR仪,是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪,PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。根据PCR退火温度和扩增条件(细胞内/外),标准PCR又可以分为三类:普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

  1996年Applied Biosystems(现被赛默飞收购)公司推出了实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术,并发明了世界上第一台荧光定量PCR仪,开始了从定性到定量的跨越。

  实时定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等),在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统,形成了具有荧光定量PCR功能的仪器,通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程,再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析,计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

  探针两端分别为报告荧光基团R和荧光淬灭基团Q,当探针完整时,R发出的荧光被Q吸收,检测不到荧光信号。探针随机结合到DNA单链上,PCR扩增时,探针被水解,R与Q分离,R发出的荧光就会被检测到。每扩增一条DNA链都会生成一个荧光分子。

  SYBR Green Ι是一种只有在和双链DNA结合时才会发荧光的染料。在PCR变性时,无荧光产生,到了复性和延伸阶段则能检测到荧光信号。

  实时荧光定量PCR仪主要应用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析等细分研究方向,广泛应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业等研究领域。

  不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法,数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。

  数字PCR是一种基于PCR反应(聚合酶链反应)的单分子绝对定量技术。如图1,在数字PCR的过程中:

  (a) PCR反应体系(含有荧光染料或探针)被分割为数以万计的均一微液滴,

  (c) 将这些微液滴收集到试管内进行PCR反应,其中含有模板的微液滴会产生扩增产物,由此具有较强的荧光,成为阳性微液滴,

  (f) 通过合理的荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化,判断出其中具有较强荧光的阳性微液滴(图1f中绿色的数据点,称为“1”)和具有较弱荧光的阴性微液滴(图1f中蓝色的数据点,称为“0”),并通过“1”和“0”的个数来实现绝对定量。因此,与实时定量PCR不同,数字PCR不需要使用标准曲线,即可直接对核酸拷贝数的绝对值进行定量。

  迄今为止,目前市面上常见的数字PCR仪器主要有两种,根据微反应的形成原理不同,主要分为 “芯片数字PCR”与“微滴数字PCR”两类。

  液滴数字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技术,即将DNA模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增,扩增后的产物富集在磁性微球上,收集破乳后进行测序。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系,比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量,而且系统简单,成本低,因此成为理想的数字PCR技术平台。

  数字PCR技术主要应用于不稳定性分析、肿瘤早期研究、产前诊断、致病微生物检测、癌症标志物稀有突变检测等研究领域,也用于验证NGS中的低频突变、 DNA甲基化检测、突变多重检测等方向。

  外壳、供电系统、电子控制系统、加热系统、制冷系统、散热系统、变温反应腔、外壳以及人机界面等共同构成了基因扩增仪。

  PCR技术的本质是体外核酸扩增,加热使双链DNA解开螺旋,在退火温度条件下引物同模板DNA杂交,在Taq DNA聚合酶,dNTPs,Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物,重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25~40个循环,呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。

  ①DNA模板:待拷贝的DNA称为模板,它可以是双链DNA也可是单链DNA,Z后扩增得到的产物是双链状态的。

  ②引物:是DNA复制的先锋,就象结晶过程中的晶核,引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

  ③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶):是DNA复制的动力,在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。

  基因扩增仪是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成,用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。

  PCR反应一般设置20~40次循环,每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高,如果循环次数是30次,那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下:

  ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

  ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

  ③引物的延伸:温度升到72℃左右,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

  基因扩增仪灵敏度高,操作起来简便、快捷,加上对特定基因样本纯度要求低,因而被广泛地运用在以下检测活动中:

  1、医学和健康检验机构临床诊断,用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断以及基因复制。

  a.梯度PCR仪:一次PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常为12种温度梯度的普通PCR仪。

  b.原位PCR:将具有细胞定位能力的原位杂交技术运用于从细胞内靶DNA的定位分析,在细胞内实现基因扩增的普通PCR仪。

  PCR扩增时加入的引物利用荧光素进行标记,使引物和荧光探针同时与模板进行特异性结合,扩增结果通过荧光信号采集系统实时采集信号并输送到计算机分析处理系统,实时输出量化结果,这样的PCR仪叫实时荧光定量PCR仪。

  可作为普通PCR仪使用,可带梯度功能,可容纳的样本量大,无需特殊耗材,温度均一性欠佳,有边缘效应,标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致

  温度均一性较好,使用的是同一个激发光源和检测器,随时检测旋转到跟前的样品,有效减少系统误差。可容纳样品量少,有的需用特殊毛细管作样品管,增加了使用成本,也不带梯度功能

  (2)均匀用力抬起反扣部分,将PCR仪顶盖向后平推,将PCR薄壁管取出。

  将PCR仪底座开关打开,再将定量PCR仪检测器开关打开。在实验之前,首先对系统预热半个小时,打开电脑,将iQ5软件启动。

  在0.2ml的薄壁管或96孔板内加入PCR反应体系,将管盖盖上,注意,不要让手指和反应管表面有接触,所以必须将一次性塑料手套戴上。按照顺序在仪器的加热孔中放入反应管。

  实验结束后将iQ5软件、荧光定量检测器及扩增系统电源关闭,将电脑关闭,将反应管取出。

  答:不同的PCR仪有不一样的优化的升降温策略,因此当向另一类PCR仪转移这类CR仪上使用的PCR步骤参数上时,需要进行试验优化。

  答:Z好不要,建议在程序运行结束之后,应当将样品从PCR仪中及时取出。当低温保存时,尽量设定比较高的温度,能够使得仪器的使用寿命延长。

  若采用样品台控温模式,当将样品台升降温到目标温度时,因为传热延迟,样品管内样品达到目标温度仍需要较长的时间,因此,当步骤时间在30s以下时,Z好使用模拟管控,若要使用样品台控温模式,那么Z好延长一倍步骤时间。

  方法:在结束运行后,热盖将自动关闭,因此会出现冷凝,这不会影响实验的结果,在离心机上放置反应管,瞬时离心使液滴回到管子底部就行。

  (2)将四个同样的空PCR管分别置于样品台的四角,从而使证热盖压在各PCR管上的压力均匀得到保证。

  出现这样的情况,原因可能是控制器或机械故障,需要运行诊断测试并记录加热速率。

  这种情况有可能是仪器某一系统启动失败或者电压太低造成的。确保同一电路中没有使用其他电器,不要在已有用电器电路上增设线.打开电源然而仪器不响应

  出现这种情况,很可能是因为插座没有插紧或者电源线脱落,只要重新插入电源就行。

  出现这种情况,很有可能是总保险丝被熔断,只要将保险丝更换就能使故障排除。

  出现这样的情况,很可能是逻辑电路或者电源的保险丝被熔断,也有可能是因为控制器,对保险丝进行更换,如果不能恢复正常,那么就咨询维修工程师。

  尽管PCR仪器不是计量仪器,然而其的作用原理和基本计量要素有很密切的关系,因此,PCR仪需要定期检测和维护。

  首先将盖子打开,然后在样品池加入95%乙醇或10%清洗液,浸泡5min,然后对被污染的孔进行清洗,使用微量移液器对液体进行吸取,使用棉签将剩余液体吸干。打开PCR仪,设定保持温度为50℃使PCR程序运行,挥发去除残余液体,通常只需要5-10分钟左右。

  对于荧光定量PCR仪,若出现荧光污染,并且样品池不是这一污染的来源,或者当热盖的松紧受到污染或残迹物的影响时,垫盖底面需要用压缩空气或纯水清洗,使样品池的孔干净,无污物阻挡光路得到保证。

  对仪器的外表面进行清洗能够使灰尘和油脂除去,然而不能达到消毒的效果,对PCR仪的外表面进行清洗Z好选择没有腐蚀性的清洗剂。

  首先关掉PCR仪,将插头拔取,将电源插口旁边的保险盒打开,将备用的保险丝换上,观察是否恢复正常。

  2)PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度不相同,如果通过检测,与设置温度相比较,各孔平均温度差超过1~2℃,那么可以对PCR实际反应温度差运用温度修正法来纠正。

  3)升、降温过程的时间控制是PCR反应过程的关键时间越短越好,如果PCR仪的降温过程高于1分钟,那么就应该对仪器的制冷系统进行检查。当PCR仪是使用风冷制冷时,其反应底座的灰尘要较彻底地清理,若是其他的制冷系统,那么应该对相关的制冷部件进行检查。

  4)通常情况下,如果仪器的温度能够采用温度修正法纠正,那么不要轻易地对仪器的电子控制部件打开或调整。

  有了很深的了解。如今,PCR的品牌都有哪些呢?最受关注的又是哪些呢?(以下品牌不分先后哦~)A. 赛默飞